不同麻醉方案以及清醒條件下大鼠大腦連接模式分析

靜息態(tài)功能磁共振成像作為一種傳統(tǒng)的成像技術(shù)在許多神經(jīng)生理學研究上有著重大的潛力。在臨床應用中多在麻醉狀態(tài)下采集影像數(shù)據(jù)，但是我們并不知道麻醉對數(shù)據(jù)采集的影響。在此我們在不同的麻醉方案下采集了大鼠的靜息態(tài)fMRI數(shù)據(jù)，并將其與清醒狀態(tài)下采集的數(shù)據(jù)進行對比，從而有了新的發(fā)現(xiàn)。結(jié)果表明在不同麻醉方案下，大腦的功能連接模式相對清醒狀態(tài)均有一定的調(diào)制，其中異丙酚麻醉下的大腦連接模式與清醒狀態(tài)下的連接模式最為接近。α-氯醛糖和異氟醚加美托嘧啶聯(lián)合麻醉組的FC模式與清醒狀態(tài)的FC模式有良好的對應關(guān)系。異氟醚組和美托嘧啶組的FC模式與清醒狀態(tài)差異最大。這些結(jié)果可以直接用于rsfMRI研究設(shè)計，以提高數(shù)據(jù)質(zhì)量、可比性和解釋。本文發(fā)表在Neuroimage雜志。(可添加微信號siyingyxf或18983979082獲取原文，另思影提供免費文獻下載服務，如需要也可添加此微信號入群，原文也會在群里發(fā)布)。

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前言：

功能磁共振的發(fā)展使得對大腦的非侵入式研究成為可能。在中樞神經(jīng)疾病以及睡眠或者麻醉等條件下，大腦的功能連接都會有受到調(diào)整的情況。重要的是在不同的物種中都有發(fā)現(xiàn)類似的功能連接網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。因此功能連接網(wǎng)絡(luò)可在研究正常大腦功能以及復雜神經(jīng)疾病的病理生理學機制時加以利用，也可用于為診斷和新療法尋找新的生物學標記。由于動物通常不在測量中施加任何任務誘導，并且可以人為通過藥物、手術(shù)以及基因編輯等技術(shù)誘發(fā)得到想要的疾病模型，所以對于神經(jīng)生物學研究而言，基于動物模型的功能連接的研究是個十分具有吸引力的選擇。此外功能連接還可以與如電生理記錄、光遺傳等一些侵入式研究方法相結(jié)合，從而可深入了解相對于正常情況下疾病誘發(fā)的功能連接改變的機制。

為防止實驗動物在數(shù)據(jù)采集時由于環(huán)境壓力以及運動產(chǎn)生偽影，所以疾病誘導以及藥物誘發(fā)的功能連接采集大多數(shù)都在全身麻醉的狀態(tài)下進行采集。然而麻醉劑可能會干擾神經(jīng)元活動、大腦代謝以及神經(jīng)血管的耦合和功能連接，一些功能網(wǎng)絡(luò)在麻醉下可以保持活性，而有些功能網(wǎng)絡(luò)的活動則會受到抑制，從而難以確定疾病或者治療對功能連接的影響。此外有新的研究結(jié)果顯示，不同的麻醉劑量以及對劑量的依賴性也會對功能連接產(chǎn)生一定的調(diào)節(jié)，而目前在臨床應用中就有幾種不同的麻醉方案，這使得對結(jié)果的概括以及meta分析產(chǎn)生了困難。

為克服麻醉產(chǎn)生的影響，現(xiàn)在已有研究在清醒狀態(tài)下采集動物的影像數(shù)據(jù)。但是這種采集方案仍有一定的局限性。為了最大程度地降低運動偽影，實驗動物常會提前在模擬的環(huán)境中進行訓練，而這些訓練可能會持續(xù)8天左右，從而使得數(shù)據(jù)的采集變得費時費力。此外即使實驗動物適應了采集環(huán)境，在采集當中仍會有自發(fā)運動和應激反應出現(xiàn)。同時對于需要強陣痛或者肌肉松弛的如急性中風或者癲癇影響的研究，也不適合在清醒的動物中進行。

由于麻醉與清醒采集各有優(yōu)缺點，所以在后續(xù)的研究中這兩種采集方法都會被繼續(xù)使用。雖然殘留的應激反應仍會有影響，但是在清醒狀態(tài)下采集得到的功能連接模式會比麻醉狀態(tài)下更能反映正常的生理狀態(tài)。因為麻醉的使用是不可避免的，所以探究不同麻醉劑相對于清醒狀態(tài)下對功能連接的影響至關(guān)重要。

盡管近期對靜息態(tài)fMRI的研究越來越多，但是只有少數(shù)研究比較了不同麻醉狀態(tài)下的功能連接，而比較麻醉狀態(tài)與清醒狀態(tài)下功能連接差異的則更為重要。而目前尚無比較不同麻醉程度和清醒狀態(tài)下功能連接差異的研究，因此我們采集了大鼠在六種麻醉狀態(tài)下以及清醒狀態(tài)下的靜息態(tài)功能磁共振數(shù)據(jù)，并計算了各種情況下皮層內(nèi)、皮層下核團以及皮層與皮層下核團的功能連通性特征，此外我們還研究了大鼠默認模式網(wǎng)絡(luò)中中樞區(qū)域的連通性。

材料與方法：

動物的提前準備：用于實驗的動物需要按照統(tǒng)一的飼養(yǎng)條件進行飼養(yǎng)，并保證其體重盡量保持一致。

麻醉大鼠的處理：

本文的研究數(shù)據(jù)來源于前期采集的數(shù)據(jù)，根據(jù)使用的麻醉劑的種類，我們將實驗大鼠劃分為6組，分別是：α-氯醛糖異氟醚組（α-chloralose (AC, n = 9; 60mg/kg)）、異氟烷組（isoflurane (ISO, n = 8;1.3%)）、美托嘧啶（medetomidine (MED, n = 8; 0.1mg/kg/h,）組、ISO與MED聯(lián)合組(ISO +MED, n =8; 0.06 mg/kg/h i.v. MED and 0.5–0.6% ISO)、異丙酚（propofol (PRO, n = 8; 7.5 mg/kg bolus and 45 mg/kg/h)）組、聚氨酯組（urethane (URE, n = 21;1.25 g/kg)）。各類麻醉劑的使用設(shè)置依據(jù)前文進行設(shè)定。根據(jù)研究結(jié)果本文使用的麻醉劑設(shè)置均可使得實驗大鼠保證良好的半球間功能連接。

試驗期間所有大鼠使用異氟烷混合于氮氧比為7:3的混合氣體中進行麻醉，生理檢測用動脈采血，藥物通過靜脈注射方式施加。隨后使用插入氣管導管進行機械通氣，術(shù)后傷口用利多卡因進行處理，并切換到預設(shè)的麻醉方案。

老鼠的頭部固定在一個通過水循環(huán)降溫的夾器中固定，并有耳釘和咬桿進一步限制頭動，藥物層面注射肌肉松弛劑盤庫溴銨，氣管連接到機械呼吸機。體溫維持在37℃左右，另外采用一套生理檢測系統(tǒng)來記錄包括直腸溫度、心電信號、呼出二氧化碳等生理信息，動脈血樣本則用于對二氧化碳和氧氣含量以及pH值進行檢測。

活體信息測量結(jié)束后，使用5%的ISO進行5分鐘的滅活處理，并注射高濃度氯化鉀溶液。在氯化鉀注射引起心臟驟停后在通氣狀態(tài)下重復采集5~10分鐘以評估硬件和機械通氣引起的噪聲對FC的影響，并為復雜網(wǎng)絡(luò)分析提供適當參考。

清醒大鼠的處理：

清醒大鼠采用訓練的方式使其習慣采集環(huán)境，在前部的麻醉階段使用與麻醉小鼠一樣的方式進行處理，前爪沿兩側(cè)固定，后爪用膠帶固定，身體在保證呼吸的情況下用泡沫塑料包裹。為其免受掃描噪聲的影響還會給其佩戴硅膠耳塞。

前期準備后大鼠會被固定在定制的支架中送入掃描艙中進行掃描，隨后將異氟烷的輸入量逐步降為0，經(jīng)過8到10分鐘的時間后開始掃描。清醒大鼠需要逐步增加在掃描艙中的時間讓其適應掃描環(huán)境。

磁共振成像:

圖像采集是用7T的布魯克動物核磁掃描儀進行采集，結(jié)構(gòu)像層內(nèi)分辨率為512*512，共采集30層圖像；功能像層內(nèi)分辨率64*64，共采集11層，層間厚度1.5毫米，TR為2秒。

對于麻醉大鼠和清醒大鼠，分別采集300和600到750個時間點，數(shù)據(jù)采集時長分別為10分鐘和20到25分鐘。雖然清醒大鼠已經(jīng)適應了采集環(huán)境，但是依然存在輕微的抖動，這可能導致分析中的偏差，為確保數(shù)據(jù)的可比較性，對清醒大鼠采集了較長的時間，在后續(xù)的分析中使用10分鐘無運動數(shù)據(jù)。

數(shù)據(jù)的預處理與分析：

對于數(shù)據(jù)的預處理首先要將數(shù)據(jù)由布魯克的數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換為NIFTI格式，下一步作時間層校正、頭動校正，并是用兩倍體素大小的高斯平滑核作空間平滑。影像的配準使用spm8作處理。在分析的時間段內(nèi)未發(fā)現(xiàn)麻醉組和清醒組有過于明顯的頭動。

功能連接的計算使用基于MATLAB和spm8的腳本完成計算，基于Paxino提出的圖譜確定了分析的多個腦區(qū)，該圖譜初步將大腦劃分為12個區(qū)域。后進一步劃分為92個腦區(qū)，以便深入進行基于圖論的復雜網(wǎng)絡(luò)的分析。而基于Lu等人的發(fā)現(xiàn)，我們確定了大鼠DMN的中樞區(qū)域并對其連接情況繼續(xù)評估。

由于在ISO和MED麻醉下，自發(fā)的BOLD波動與頻率為0.159赫茲的電活動有較好的關(guān)聯(lián)，因此在功能連接計算前需要作器做0.01到0.15Hz的帶通濾波處理。此外基于功率譜的分析結(jié)果顯示在0.15赫茲以后非生理性噪聲明顯增加。在使用皮爾遜相關(guān)計算腦區(qū)間連接時發(fā)現(xiàn)平均最高連接值僅為0.03，因此主要對正連接進行分析。后面使用去除線性趨勢來代替帶通濾波器，使用快速傅里葉變換計算BOLD信號的功率譜。后面使用Aedes趨勢估計對組水平功率譜數(shù)據(jù)作平滑處理。

在作連邊的統(tǒng)計前需要用fisher-z轉(zhuǎn)換將連接值轉(zhuǎn)換到Z分數(shù)，使用MATLAB以及GraphPad進行統(tǒng)計，組數(shù)水平的信息呈現(xiàn)使用均值±標準差的形式進行呈現(xiàn)。

結(jié)果：

實驗中我們對共70只大鼠采集了清醒以及6種麻醉狀態(tài)下的自發(fā)性BOLD信號。后面還在滅活后采集了數(shù)據(jù)，以評估硬件設(shè)備與通風系統(tǒng)對功能連接的影響。

生理信息比較:

麻醉組所測量得到的生理參數(shù)均在正常范圍內(nèi)，經(jīng)統(tǒng)計比較表明，組間的體重以及二氧化碳以及氧含量等血氣指標無明顯差異。而與其他麻醉劑相比，美托嘧啶作用下誘發(fā)的心率更低，因此導致組間存在差異。美托嘧啶的這種副作用也是其作用的特征。AC組pH值要略高于ISO和URE組，但是都在正常范圍內(nèi)。

Table 1 靜息狀態(tài)功能磁共振成像大鼠的生理參數(shù)。

測量訓練前后大鼠的皮質(zhì)酮含量，發(fā)現(xiàn)訓練前后無明顯差異，說明大鼠已經(jīng)基本適應掃描環(huán)境。由于前后的皮質(zhì)酮水平無明顯差異，所以可提取兩個時間點的數(shù)據(jù)用于統(tǒng)計，以增強統(tǒng)計效力。

此外對于頭動信息來說，清醒組的平均頭動均在可接受范圍內(nèi)，相對體素大小在2.8±0.2%。而一般人類頭動在體素大小4%到10%之間。而其最大頭動約為體素大小的1/3；麻醉大鼠則未見頭動。

功能連接指標以及平均連接信息：

而組水平功能連接如圖1a所示，ROI間的平均連接如圖1B所示。只有來自伏隔核和下丘腦的連接顯示出持續(xù)低的連接。

Figure 1 在清醒、麻醉和死后條件下獲得的組級功能連接(FC)矩陣(A)和相應區(qū)域特定的平均相關(guān)系數(shù)(B)

與清醒組相比，ISO（異氟烷組）麻醉作用下，其功能連通型受到調(diào)節(jié)作用較重。所有皮層間連接均顯著增強，皮層與皮層下之間的連接有64%，而皮層下連接有33%均有所增強。整個皮層和紋狀體的特定區(qū)域平均功能連接很高，但在其余區(qū)域，尤其是內(nèi)側(cè)丘腦和下丘腦大幅下降。

在MED（美托嘧啶）麻醉下，與清醒組相比，FC被全面抑制。如果不考慮伏隔核和下丘腦，89% (40/45)的剩余連接被抑制，包括92%(11/12)的丘腦-皮層連接。特別是在皮層和紋狀體區(qū)域特異性以及平均功能連接也很低。

當ISO和MED同時使用(ISO+MED)時，只有33%(5/ 15)的皮層間連接減弱;皮層下區(qū)域間連接約53%(8/15)減弱。然而，大量皮層-皮層下連接(50%)被ISO+MED削弱，其中包括75%(9/12)的丘腦-皮層連接。

PRO（異丙酚）組12個ROI構(gòu)成的連接矩陣與清醒組比較再經(jīng)FDR校正后，無具有統(tǒng)計學意義的差異。然而，皮層區(qū)域的連接值似乎略高于清醒組(見圖1中的92個ROI矩陣)。PRO組觀察到的顯著較高的方差可能限制了檢測能力。而源自伏隔核和內(nèi)側(cè)丘腦的區(qū)域特異性FC受麻醉作用被抑制。

URE（聚氨酯組）麻醉下的FC模式與清醒組比較接近；只有6%的連接被顯著抑制。92個ROI組成的矩陣在視覺上與清醒組相似，但連接略低。在區(qū)域特異性的平均FC分析中，URE麻醉使紋狀體、丘腦內(nèi)側(cè)和丘腦腹外側(cè)的連通性減弱。

在滅活個體數(shù)據(jù)的FC矩陣中，僅觀察到很微弱的連接，這表明硬件誘發(fā)的噪音、機械通氣相關(guān)的運動和數(shù)據(jù)處理誘發(fā)的偽影對我們的發(fā)現(xiàn)并無特別的影響。

默認模式網(wǎng)絡(luò)節(jié)點、皮層連接以及復雜網(wǎng)絡(luò)分析：

圖2A中展示了默認模式網(wǎng)絡(luò)前額以及后部區(qū)域的功能連接。除脾后質(zhì)以及海馬外，ISO組的DMN區(qū)域的連接要顯著高于清醒組。這可能說明麻醉作用抑制了以遠距離連接為主的前額區(qū)域的活動。與清醒大鼠相比，麻醉大鼠DMN后半部分的連接相對更接近也更高，而PRO（異丙酚）組大鼠DMN的連接與清醒組更相似。

圖2B中展示了源自于體感皮層的5個具有代表性的連接區(qū)域，除了ISO組和MED組外，所有麻醉組的皮層內(nèi)連接與清醒組相差不多。然而受到麻醉的影響皮層到丘腦以及皮層到下丘腦的連接被破壞。各組半球間皮層連接的差異與皮層內(nèi)平均連接的差異密切相關(guān)。Figure 2默認模式網(wǎng)絡(luò)(A)、軀體感覺皮層(B)、半球間皮層功能連接(C)和(D)復雜網(wǎng)絡(luò)參數(shù)

通過復雜網(wǎng)絡(luò)分析得到的參數(shù)如圖2所示，ISO組模塊化水平顯著降低，PRO組也有類似的發(fā)展趨勢。而ISO和MED聯(lián)合用藥組以及MED組的組平均度值降低，其他則與清醒組相當。AC組、URE組以及ISO與MED聯(lián)合用藥組的平均距離則略有增加。ISO組的平均距離顯著增加，MED組則表現(xiàn)出相反的趨勢。

BOLD信號的能量譜分析：

圖4展示了丘腦以及其他主要皮層腦區(qū)組水平的能量譜信息。清醒組中，自發(fā)信號波動在觀察的頻率范圍內(nèi)相對穩(wěn)定，而在麻醉狀態(tài)下功率譜峰值僅在一個比較窄的范圍內(nèi)，且不同的麻醉方法也有不同。此外，能量譜曲線表明丘腦和皮質(zhì)之間存在獨立(如AC、ISO和MED)或共享(如AC、ISO或MED、PRO和URE)波動。

在ISO組中，0.05到0.12Hz范圍內(nèi)皮層的能量譜最強，而腹側(cè)丘腦的的活動則被完全抑制了。相較于ISO組，ISO+MED組在0.19Hz等更高的頻段上功率更大。并且其主要的高能活動區(qū)域主要集中在丘腦上。與ISO+MED組相比，MED組中皮質(zhì)波動的強度最小，而在0.13 Hz左右的丘腦中觀察到明顯的峰值。

在AC組中，低頻和高頻(約0.18 Hz)下均觀測到皮質(zhì)波動。在丘腦中也觀察到了類似的功率譜增加，雖然在皮層中不可見，但丘腦在0.07 Hz左右表達了一個額外的峰值。在PRO組中，自發(fā)波動主要集中在兩個區(qū)域的低頻區(qū)(0.02±0.04Hz)，而其余頻率似乎與滅活組無差異。在URE組中，皮層和丘腦區(qū)域的頻譜功率在0.10 Hz左右有所增加。Figure 4血液氧合水平依賴信號的組級譜功率，來自八個組。黑線表示無顯著性差異(n.s.)，紅線表示與清醒組的差異(p <0.05, t檢驗，錯誤發(fā)現(xiàn)率修正)。小的綠色箭頭表示大腦皮層和丘腦中類似的峰值，而藍色箭頭表示只出現(xiàn)在這兩個區(qū)域中的一個

在小于0.05赫茲的低頻范圍內(nèi)，相對于滅活數(shù)據(jù)，皮層的功率譜有明顯增加。事后的數(shù)據(jù)分析也表明，從0.16赫茲開始，外部信號引起的功率譜有所增強。有可能丘腦區(qū)域的信噪比教低，導致在丘腦區(qū)域的噪聲更為突出。

討論：

基于我們的知識體系，本研究拓展了在麻醉和清醒狀態(tài)下大鼠大腦連接性的數(shù)據(jù)。該研究結(jié)果也與前人的成果保持一致，也證明了不同的麻醉方式對于大鼠腦內(nèi)連接有著不同的調(diào)制。更為重要的是，基于這批數(shù)據(jù)，我們能夠在使用相同的掃描條件下以清醒大鼠的數(shù)據(jù)為參考來確定麻醉對連接的特定改變。

麻醉誘發(fā)的外圍信息流中斷問題：

丘腦是外部與皮層區(qū)域進行信息交互的重要區(qū)域，而許多麻醉誘導的意識喪失其相關(guān)的潛在通路都涉及到了丘腦。由腦橋、丘腦核下丘腦控制的激發(fā)和抑制網(wǎng)絡(luò)之間的平衡轉(zhuǎn)換被假設(shè)在麻醉中是必須的。在清醒狀態(tài)下，丘腦到皮層的通絡(luò)允許信息流經(jīng)過丘腦到達皮層。相對之下，在麻醉時，丘腦到皮層的通路中通常會出現(xiàn)低頻猝發(fā)模式，從而阻斷丘腦到皮層的信息流動以及皮層對信息的處理。更為重要的是，這種皮層到丘腦的突發(fā)模式可廣泛擴散到雙側(cè)皮層區(qū)域。

本研究的結(jié)果與上述結(jié)果一致。首先，清醒組中測得FC顯示皮下區(qū)域和皮層腦區(qū)有明顯的功能連接性；復雜網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果顯示其平均度值高、平均距離短，說明存在多連接，且有效路徑多的網(wǎng)絡(luò)，這與清醒大腦所預期的相符。而且其神經(jīng)活動在較寬的頻率范圍內(nèi)都呈現(xiàn)較高的功率，這也符合清醒被試中的預想假設(shè)。

第二，通過麻醉大鼠與清醒組的統(tǒng)計比較為麻醉對丘腦-皮層活動產(chǎn)生影響的觀察提供了證據(jù)；所有的麻醉實驗組均呈現(xiàn)除對丘腦和下丘腦的抑制。在一些麻醉組中發(fā)現(xiàn)皮層自發(fā)的bold活動尤其明顯，而這可能與丘腦到皮層的突發(fā)性的活動有關(guān)。同時這種FC的連接模式也有向鄰近區(qū)域擴散的情況（圖1 AC，ISO以及PRO），這也指向低頻、特異性較低的丘腦到皮層通路的阻斷。而幾乎所有的麻醉劑均通過如改變模塊數(shù)量、減少連接數(shù)量或者增長平均路徑長度來對腦網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)作顯著的調(diào)整。最后所有麻醉組的bold信號均有所抑制；而在每組中觀察到的具有相對窄范圍內(nèi)波峰的特征性頻率分布，這可能說明麻醉誘發(fā)了爆發(fā)性活動以及FC的動態(tài)降低。

不同麻醉方案對大腦功能性連接的特征性影響：

現(xiàn)在已有多項說明麻醉誘發(fā)的FC對于麻醉劑類型及其劑量存在依賴。同樣的，近來也有多項研究表明清醒狀態(tài)與麻醉狀態(tài)之間的功能網(wǎng)絡(luò)之間存在差異，但是大多只評估了一種麻醉劑作用下的差異，從而很難對多種麻醉劑進行對比。后續(xù)將重點對fc相關(guān)的發(fā)現(xiàn)進行描述。

α氯醛糖（α-Chloralose (60 mg/kg)，AC）組分析結(jié)果：AC麻醉組大鼠雖然保持著與清醒時相似的FC結(jié)構(gòu)，但是FC模式似乎受到了全面的抑制，而皮層內(nèi)連通性與之前的大鼠研究相似，與清醒組相比，皮層內(nèi)有被很好的保存下來。前人也有報道過紋狀體和皮層之間的連通性，這與我們的研究結(jié)果相似。然而，在目前的研究中，來自紋狀體的連接強度明顯弱于清醒組。

盡管作者證明了能量譜峰值出現(xiàn)在略低的頻率范圍內(nèi)，但是AC組中在約0.18 Hz的頻段上皮質(zhì)能量譜峰值也與先前的研究一致。在本研究中，除丘腦在0.07 Hz處有一個在皮層中不可見的小峰值外，在丘腦和皮層中相似的頻率下BOLD信號能量有所增加。因此，能量譜分析可以支持基于ROI的分析比較；丘腦-皮層BOLD波動表明在AC麻醉下丘腦-皮質(zhì)活動在保持和斷開之間切換。

總之，我們的觀察結(jié)果表明，AC是rs-fMRI研究的潛在麻醉劑；盡管其顯著抑制了連接性，但皮層內(nèi)連接模式與清醒狀態(tài)下有許多相似之處，丘腦與皮層見的耦合似乎保留了一部分。
異氟醚(1.3%)（Isoflurane (1.3%)）。在ISO組中，在整個皮層和紋狀體區(qū)域觀察到高連接。根據(jù)連通性矩陣和連接分布圖，這些區(qū)域具有相似的強BOLD波動特征，表明存在廣泛的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。受影響的如低模塊化(或描繪的子網(wǎng)數(shù)量)和高集群連通性等復雜網(wǎng)絡(luò)參數(shù)，也與這些觀察結(jié)果一致。由于對大規(guī)模同步網(wǎng)絡(luò)的檢測是穩(wěn)健的，并且其性質(zhì)對劑量呈現(xiàn)依賴性，且網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與清醒數(shù)據(jù)明顯不同，因此可以認為該現(xiàn)象是大鼠ISO麻醉的特定性特征。先前基于腦電圖技術(shù)測量的工作表明，新皮質(zhì)的同步化源于ISO誘導的爆發(fā)抑制活動。

與額部皮層區(qū)功能連接強度顯著增加相反，ISO嚴重抑制了丘腦到皮層及皮層下核團的大部分連接，這與先前的研究一致。此外，我們的能量譜分析表明丘腦的波動強度可以忽略不計，這進一步表明了ISO誘導的丘腦活動抑制。相反，即使與清醒大鼠相比，皮層波動的頻譜能量也較高，表明在ISO麻醉下丘腦到皮層的連接呈現(xiàn)明顯斷開的狀態(tài)。

相對于已發(fā)表的數(shù)據(jù)來說，與大鼠皮層BOLD波動頻率相關(guān)的信息通常更具異質(zhì)性。Kalthoff等人報告了低頻時的大部分能量譜，而Williams等人報告了除低頻外的能量增加。在本研究中，在較寬的頻率范圍(0.05±0.12Hz)內(nèi)觀察到皮層能量譜的相應峰值，與之前描述的范圍部分重疊。因此，低頻時的高功率一般比較容易被檢測到，而高頻時的峰值功率可能不存在，或者說在0.05和0.15 Hz之間變化，這很可能源于不同水平的脈沖抑制效應。

結(jié)合之前的研究，我們的結(jié)果表明麻醉劑量的ISO麻醉劑通過誘導皮層和紋狀體的同步波動以及皮質(zhì)下活動陷入沉寂，嚴重掩蓋了大鼠自然發(fā)生的功能活動，這兩種情況在清醒大鼠中都不常見。然而，這些影響可以通過使用低劑量的ISO來最小化。
MED組（Medetomidine(0.1毫克/公斤/小時)）。MED組的連接較清醒組低。此前也有類似的連接報告，但其中一些研究報告的值要略高。與這些觀察結(jié)果一致的是，Kalthoff等人測得較低的皮層到紋狀體連通性強度，Williams等人報道了網(wǎng)絡(luò)間功能連接的減少。然而，在本研究中，MED麻醉下的皮質(zhì)間連通性是中等的，這對先前半腦間良好連接得網(wǎng)絡(luò)特異性提供了支持。

MED組皮質(zhì)波動的功率譜密度也極低；與滅活個體數(shù)據(jù)相比，主要在頻率低于0.03 Hz處觀察到增加，這以一結(jié)果與以前的報告一致。此外，有研究表明能量可能在0.10±0.18Hz左右增加，這也與我們的發(fā)現(xiàn)相吻合。與皮質(zhì)相比，在丘腦中觀察到了相對清晰的能量譜峰值。在皮質(zhì)中未觀察到類似的峰值，表明MED麻醉導致丘腦和皮質(zhì)的自發(fā)性波動去同步化。

綜合來看，MED麻醉下的BOLD波動似乎被全面抑制；FC模式與清醒組明顯不同，僅部分可與其他麻醉組比較。
異氟醚(0.5-0.6%)聯(lián)合美美托嘧啶(0.06 mg/ kg/h)（Combination of isoflurane (0.5-0.6%) and medetomidine (0.06 mg/kg/h)）。與單獨使用ISO或MED的結(jié)果相比，ISO + MED的總FC模式更接近清醒組數(shù)據(jù)；ISO + MED組與清醒組差異最大的原因是部分抑制了皮層下連接和丘腦到皮層的連接。皮層內(nèi)連接輕度受損，導致半球間的良好連接和皮層內(nèi)連接類似于清醒狀態(tài)。良好的皮層連通性可能是由于ISO的血管舒張效應和MED的血管收縮效應共同作用的結(jié)果，但也可能是由于每種麻醉劑的劑量較低，從而減少了混雜效應；然而，確切的相互作用是復雜和難以預測的。

可能由于ISO+MED聯(lián)合麻醉這種麻醉方案過于新穎，導致其關(guān)于皮層到皮層下或丘腦到皮層連通性的報道很少。我們的研究結(jié)果對Lu等人在脾后皮質(zhì)和海馬之間存在中度連接的結(jié)論提供了支持。在本研究中，腹外側(cè)丘腦與皮層之間的連接與清醒狀態(tài)相似，而內(nèi)側(cè)丘腦或下丘腦與皮層之間的連接在ISO+ MED麻醉下幾乎完全減弱。

在ISO+MED組中，皮層和丘腦能量譜均在0.18 Hz左右出現(xiàn)峰值。盡管在ISO+MED組中出現(xiàn)的波動頻率更高，這與在小鼠中報道的類似，但皮質(zhì)能量的增加與ISO組相當。與ISO組不同的是，在丘腦中也出現(xiàn)了波動強度的增加，這與MED組相似。這些觀察結(jié)果表明，在ISO+MED組中，ISO和MED麻醉劑對BOLD信號的波動均有影響。

有趣的是，ISO+MED組的一些結(jié)果似乎與一種聯(lián)合麻醉藥有關(guān)。例如，ISO組、ISO+MED組和MED組的結(jié)果表明，下丘腦連接障礙僅為ISO驅(qū)動效應，而MED組抑制海馬BOLD波動。因此，除了制定對FC混淆效應較小的方案外，在rsfMRI研究中聯(lián)合使用麻醉劑也可能為麻醉劑的作用機制提供新的理解。

本研究的結(jié)果促進了ISO+MED麻醉在縱向臨床前fMRI研究中的應用。與單獨使用ISO或MED的研究設(shè)計相比，FC模式具有良好的皮層和部分保留的丘腦-皮層連接，顯然類似于清醒狀態(tài)。
異丙酚(7.5 mg/kg t 45 mg/kg/h)（Propofol (7.5 mg/kg t 45 mg/kg/h)）。一般情況下，PRO組的連接模式與清醒組相似。觀察到的顯著差異主要是源于皮層下區(qū)域的連接。而PRO組的統(tǒng)計偏差顯著較高，影響了檢測能力。這種偏差可能源于FC復雜而對劑量依賴性的敏感變化，因為在PRO劑量為40和60 mg/kg/h時，FC在皮層中發(fā)生的特別的動態(tài)變化。與清醒組相比，PRO組的連接模式特異性較低。根據(jù)相關(guān)矩陣，BOLD波動在鄰近區(qū)域更為普遍，特別是皮層內(nèi)和皮層到皮層下連接。這些觀察結(jié)果得到了復雜網(wǎng)絡(luò)分析的進一步支持，在復雜網(wǎng)絡(luò)分析中觀察到模塊化降低的趨勢。這種現(xiàn)象的程度明顯小于ISO組，但仍可能表明麻醉誘導的皮層活動的整體性調(diào)節(jié)。在之前的研究中，在PRO劑量為60mg /kg/h時，皮層相關(guān)體素的數(shù)量也很高，這進一步支持了我們的觀察。

與許多其他麻醉劑相比，在PRO麻醉下，丘腦到皮層的同步始終能檢測到。與我們的結(jié)果一致的是，Liu等人也檢測到了丘腦與扣帶皮層和脾后皮層等區(qū)域的連接。此外，即使在高劑量的PRO下，也很好的保留了皮層下的活動。

與其他麻醉劑類似，PRO能顯著抑制BOLD波動的能量譜。在大腦皮層和丘腦中，均存在0.05 Hz的顯著功率波動，表明各區(qū)域具有相似的波動特性以及潛在的連接基礎(chǔ)。

綜上所述，PRO麻醉誘導的FC模式與清醒狀態(tài)驚人地相似。皮層內(nèi)連通性較強，但特異性較低，丘腦到皮層的同步性得以維持。如果能夠獲得最佳麻醉深度窗口和穩(wěn)定性，異丙酚在臨床前rsfMRI研究中是一種非常有前景的麻醉劑。
聚氨酯(1250毫克/公斤)（Urethane (1250 mg/kg)）。URE組麻醉大鼠的FC與清醒組的FC相似。皮層內(nèi)和丘腦到皮層的連接良好，ROI矩陣的FC模式可能最接近清醒組。然而，其連接要略低于清醒組，且部分紋狀體和丘腦連接受到URE的顯著影響；這可能暗示了特定的丘腦到皮層的連接障礙以及聚氨酯的麻醉機制。

盡管URE常用于電生理和藥理學研究，但對URE麻醉大鼠的FC研究很少，缺乏全腦分析。然而，我們的結(jié)果得到了類似的連接的支持，這些連接來自皮層到海馬、皮層內(nèi)以及丘腦到皮層的連接。有一些研究調(diào)查了在被URE麻醉的小鼠的FC，但是跨物種之間的比較相對困難。然而，Grandjean等人在URE麻醉下檢測到相對良好的皮層和丘腦間的連通性，該結(jié)果與PRO麻醉效果類似。這些觀察結(jié)果與我們的分析結(jié)果也相對一致。

URE組的BOLD波動強度被廣泛抑制。數(shù)據(jù)表明，在大腦皮層和丘腦中，波動主要發(fā)生在0.03 Hz和0.10 Hz范圍內(nèi)。這些觀察顯示了明顯的麻醉誘導的自發(fā)活動抑制，以及丘腦和皮層的同步。

綜上所述，我們的結(jié)果表明，FC僅在URE麻醉中有輕度調(diào)節(jié)；與其他幾種麻醉劑相比，皮層內(nèi)連通性良好且更具體。此外，與其他麻醉劑相比，丘腦皮層內(nèi)連通性被很好的保存了下來，然而，URE誘導的類睡眠活動可能會導致FC數(shù)據(jù)的額外變化。

清醒大鼠功能連接的探索和解釋：

首先假設(shè)大腦具有不同的加工層次，可分為自我參照沖動心理活動和內(nèi)在基線活動的核心特征。由于無意識的大腦缺乏自我參照的沖動心理活動，這表明了清醒的大腦和麻醉的大腦之間的根本區(qū)別。也有人認為，由于認知處理、疼痛感知和運動等功能受到抑制，麻醉的大腦更好地代表了基線活動。本研究中基于頻譜分析的結(jié)果也對這一假設(shè)提供了支撐。

然而，在不同的麻醉方案中，麻醉后大腦的FC并不相似。眾所周知，麻醉藥對神經(jīng)活動和神經(jīng)血管的耦合機制有不利影響，這阻礙了rsfMRI FC數(shù)據(jù)的解釋。雖然目前的工作不能解開這些因素對FC的貢獻，但我們的結(jié)果揭示了不同麻醉處理凈效應的關(guān)鍵差異。

正如人們所料，麻醉下獲得的FC模式均與清醒組不同。事實上，與清醒狀態(tài)相比，一些麻醉方案產(chǎn)生了明顯不同的連接模式。在事先不知情的情況下，使用此類麻醉方案會極大地阻礙檢測，甚至掩蓋正在研究的神經(jīng)活動現(xiàn)象。相比之下，在事先知情的情況下，可以嘗試避免此類陷阱，甚至可以利用麻醉方案的特征實現(xiàn)特定的觀察。例如，在已知麻醉劑會增強BOLD波動的麻醉條件下，可以研究特定神經(jīng)元途徑中的病理生理學變化。

然而，一些臨床前方法對全腦連接更感興趣。本研究中的大多數(shù)麻醉方案保持了良好的皮層間連接。因此，可以推薦至少保留一定程度丘腦皮層間連接的麻醉方案。因為丘腦到皮層間連接在如癲癇等幾個假設(shè)的疾病機制中起著關(guān)鍵作用，所以它是功能神經(jīng)影像學中一個主要的課題。

雖然本研究未涵蓋FC的動態(tài)變化，但需要注意的是，麻醉和清醒大腦之間的動態(tài)特性可能不同。由于清醒的大腦可以自由自發(fā)地啟動、維持和結(jié)束活動，因此動態(tài)特征可能會更加多樣。然而，麻醉狀態(tài)下的FC也不穩(wěn)定，因為已在從秒到分鐘到小時等各種不同的時間尺度上檢測到連通性變化。在包括長期測量在內(nèi)的研究設(shè)計中，考慮FC的長期變化尤為重要，這很可能是由于麻醉深度的變化所致。然而，成像期間清醒受試者中發(fā)生的感知和認知功能的動態(tài)改變可誘發(fā)更復雜和不可控制的變化，使用輕度麻醉方案可相對容易地抑制這些變化。

默認模式網(wǎng)絡(luò)：

DMN可能是研究最為廣泛的大腦大尺度功能網(wǎng)絡(luò)。在不同物種和不同意識水平下都可以觀察到與人類DMN相似的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，表明DMN在哺乳動物大腦基礎(chǔ)功能中具有非常重要的作用。據(jù)報道，DMN的一個常見特征是其在任務期間呈現(xiàn)失活狀態(tài)。然而，根據(jù)雷切爾的說法，在這些情況中可能更多的是對DMN進行調(diào)節(jié)而不是關(guān)閉DMN。

在本研究中，我們探究了清醒和麻醉條件下大鼠DMN關(guān)鍵節(jié)點之間的連接。我們的結(jié)果支持了在不同麻醉方案中至少部分保留DMN效應的觀點，但DMN在麻醉誘導后也存在顯著的連接調(diào)制現(xiàn)象。重要的是，在ISO麻醉下新皮質(zhì)的廣泛同步化在整個DMN區(qū)域誘發(fā)了異常高的連接。因此，如果在任何類型的麻醉下檢測到此類高度相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)活動時，都需要謹慎得出與DMN相關(guān)的結(jié)論。

與清醒組相比，ISO以外的麻醉組的功能連接似乎較低，尤其是在DMN的額葉前部區(qū)域；這些區(qū)域與諸如社交行為、情緒控制、動機驅(qū)動和感知處理的過程相關(guān)聯(lián)。因此，DMN前額葉區(qū)域連通性的下降可能與意識喪失直接相關(guān)。在人類中，在鎮(zhèn)靜會降低后扣帶回皮層中的DMN強度，而這也是與意識有關(guān)的。

與DMN的額葉部分相比，麻醉大鼠的DMN后部的連接與清醒組較為相似或甚至更為活躍。觀察到后部區(qū)域FC明顯增加，尤其以海馬最為明顯。有趣的是，DMN的后部與記憶網(wǎng)絡(luò)中的回憶功能有關(guān)，這些功能在晚上以及睡眠的早期階段可能非?；钴S。由于非快速眼動睡眠和麻醉在神經(jīng)生理學和大腦活動方面有許多相似之處，我們的觀察結(jié)果表明在DMN調(diào)制方面確實存在相似之處。

值得注意的是，在本研究中，與麻醉大鼠相比，清醒組的感知加工和注意過程可能導致DMN狀態(tài)的更高變異性。然而，這些狀態(tài)變化對連接的確切影響尚不清楚。

方法學的一些考慮：

我們主要的研究發(fā)現(xiàn)與前人的發(fā)現(xiàn)有著驚人的一致，但是因為一些細節(jié)的不同導致我們的結(jié)果之間存在一定的差異。首先，不同研究之間的fMRI采集方式不同：本研究中的rs-fMRI測量值是使用自旋回波序列獲得的，而大多數(shù)先前的研究使用梯度回波序列。與梯度回波相比，自旋回波在高磁場下對于毛細血管具有更高的水平特異性，受磁化率誘發(fā)的偽影影響更小，且對生理噪聲的敏感性更低。相對的是，梯度回波序列的靈敏度更高，這有利于檢測較弱的血流動力學信號。

第二，不同研究的動物制劑有很大差異：如大鼠勞損、麻醉劑量、給藥途徑、通氣使用或既往麻醉經(jīng)歷等因素的差異都可能導致FC的不同構(gòu)成。FC測量的時間窗也至關(guān)重要，FC在誘導后的半小時至幾小時之間會產(chǎn)生不同變化。由于麻醉劑對FC的影響似乎對劑量和時間呈現(xiàn)依賴性，因此也不能低估這些因素的影響。然而，本研究中的發(fā)現(xiàn)與先前的發(fā)現(xiàn)有驚人的相似之處，表明不同研究背景之間的結(jié)果具有較好的可再現(xiàn)性。

依據(jù)先前的研究表明，運動、呼吸頻率和心率等生理噪聲對大鼠FC的影響很小，原因如下：首先，已經(jīng)使用麻醉方法使動物無法運動，并且僅使用來自清醒動物的無運動數(shù)據(jù)。其次，通過通氣獲得的滅活個體數(shù)據(jù)顯示，呼吸運動并沒有對FC產(chǎn)生明顯的誘發(fā)的影響。第三，數(shù)據(jù)表明心率和FC之間沒有明確的聯(lián)系。例如，ISO+MED和MED組的心率相似，但FC模式和BOLD功率譜不同。然而，還是不能完全排除如源于心跳的搏動等生理噪聲的干擾。

在實驗中手術(shù)持續(xù)了37±2min，從停止初始ISO麻醉到開始rs-fMRI掃描之間的時間為38±2min。由于在準備和fMRI測量之間留出了足夠的時間，因此預計手術(shù)期間使用ISO的延遲效應最小。

結(jié)論：

本研究解釋了不同麻醉方案對FC產(chǎn)生的不同的調(diào)制，同時也觀察到了不同麻醉方案誘發(fā)FC與清醒被試的FC的不同。相對于清醒組大鼠，在PRO和MED組被試受麻醉誘發(fā)產(chǎn)生的連接指標的差異最小。AC組和ISO+MED組被誘導下的連接模式與健康被試最為接近，ISO和MED組的連接模式則與健康組相差最大。結(jié)合先前的與麻醉相關(guān)的藥理學知識，即可用于rs-fMRI的實驗設(shè)計和結(jié)果解釋。但是還需要進一步研究FC對麻醉的時間、劑量等因素是如何依賴的，以便進對動物rs-fMRI的掃描工作作進一步的優(yōu)化。

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